细菌染色法

总论

图1：多种多样的细菌染色方法

细菌有多种染色方法，其中最重要的是革兰氏染色法（Gram’s Stain）。
染色可分为正染（Positive Staining）和负染（Negative Staining）：
- 正染：对细菌的细胞进行染色，环境不被染色。
- 负染：对细菌生活的环境进行染色，细胞不被染色。
正染的染料与细胞可通过离子键、共价键、疏水键结合。
最常用的正染染料通过离子键与细胞结合，分为酸性染料、碱性染料。
- 酸性染料：伊红（Eosin）、二碘曙红（玫瑰红，Rose Bengal）、酸性品红（Acid Fuchsin）。
- 碱性染料：亚甲蓝（Methylene Blue）、碱性品红（Basic Fuchsin）、结晶紫（龙胆紫，Crystal Violet）、番红（Safranin）、品绿（孔雀绿，Malachite Green）。
只使用一种染料的染色方法称为简单染色（Simple Stain）。
使用多种染料分类染色的方法称为分化染色（Differential Stain）。
常见的分化染色：革兰氏染色、抗酸染色（Acid-fast Stain）。
有些染色方法专门用于染色特定结构：
- 荚膜染色法（Capsule Staining）：用墨汁（India Ink）或苯胺黑（Nigrosin）染色，背景比荚膜染色较深，属于负染。（观察硫细菌细胞内的硫颗粒亦可用此法）
- 芽孢染色法（Endospore Staining）：一般用Schaeffer-Fulton法。将细菌与品绿共热，用水脱染，用番红复染，属于正染，分化染色。
- 鞭毛染色法（Flagellate Staining）：用铝钾矾（硫酸铝钾）或鞣酸（Tannic Acid）包裹鞭毛（增粗），然后用副蔷薇苯胺（副玫瑰红，Pararosaniline）或碱性品红染色，属于正染。

固定细胞

给细菌染色的第一步是固定细胞。
固定细胞的方法有：热固定法（Heat Fixation）、化学固定法（Chemical Fixation）。
热固定法：将细胞薄层在本生灯（Bunsen Burner）上微热，会破坏细胞内部结构。（较常用）
化学固定法：在细胞薄层上滴加乙醇、乙酸、氯化汞、乙醛或戊二醛，不会破坏细胞内部结构。

革兰氏染色法

图2：革兰氏染色法

实验过程

取一个载玻片，用硼砂粉末擦拭，冲洗干净，用纸巾擦干。
在载玻片上3处各滴一滴蒸馏水。（也可只滴2处，见下文）
在本生灯上加热接种环至红热，冷却。
将接种环浸入培养基，再浸入其中一滴蒸馏水，重复直至这滴蒸馏水变为轻微浑浊。
将接种环埋入酒精浸没的沙子中，再在本生灯上加热至红热，去除残留细菌细胞。（不浸入沙子直接加热会有轻微爆炸声）
用革兰氏阳性菌（如葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）接种另外两滴蒸馏水，作为对照。（如果只滴2处，把革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌混合在同一滴中）
等待载玻片风干。（约5-10分钟，不能加热，否则破坏细菌）
载玻片干后，用镊子夹住载玻片快速通过本生灯火焰2-3次，微热固定细菌。（载玻片底部摸起来不能烫）
初染：将载玻片用结晶紫完全覆盖，静置6-30 s，倒掉染料，用蒸馏水冲洗5秒。（细菌已被固定，不需担心细菌流失）
媒染：将载玻片用碘液完全覆盖，静置12-60 s，倒掉染料，用蒸馏水冲洗5秒。（_革兰氏阳性菌中，碘和结晶紫组成复合体，卡在细胞壁和内膜之间_）
脱染：将载玻片用镊子斜45°夹住，滴加丙酮或乙醇，至不再滴出紫色染料，立刻用蒸馏水冲洗。（本步时间很关键，最好1-2 s，最多5 s）
复染：将载玻片用番红或其它染料完全覆盖，静置10-30 s，倒掉染料，用蒸馏水冲洗。
用纸巾吸去载玻片上的水。（但不能擦拭）
在显微镜下观察结果。（最好用油浸润显微镜）

实验结果

被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌（Gram-positive Bacteria）。
被染成红色的细菌称为革兰氏阴性菌（Gram-negative Bacteria）。
大多数革兰氏阳性菌属于厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）。
支原体（Mycoplasma）属于厚壁菌门，却是革兰氏阴性菌。
奇异球菌（Deinococcus）不属于上述两个门，却是革兰氏阳性菌。
实验结果错误的三个关键原因：
- 细菌培养时间过长，革兰氏阳性菌会变成阴性菌。（原因不明）
- 脱染时间过长，革兰氏阳性菌会呈现阴性菌。
- 被染色的细菌悬浮液过浓，染色会不均匀。（培养基中的悬浮液一般很稀，不用担心此问题）

抗酸染色法

实验过程

在载玻片上准备材料，参考革兰氏染色。
初染：将载玻片用碳酸复红（Carbofuchsin）覆盖3-5 min，不用加热，然后冲洗。
脱染：滴加酒精-HCl溶液，10-30 s后冲洗。
复染：滴加甲基蓝，20-30 s后冲洗。
干燥后在油浸润显微镜下观察。

实验结果

支原体被染为粉红色，其它细菌被染为蓝色。

细菌细胞结构染色法

荚膜染色法

在载玻片上滴一滴细菌悬浮液，再滴一滴墨汁。
轻轻放下盖玻片，要让两滴液体混合，且形成墨汁的浓度梯度。
在显微镜下寻找，可找到黑色背景下荚膜呈现白色。
因为这个过程不会杀死细菌，观察结束后要高温处理载玻片。

芽孢染色法

方法1

将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。
滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6%）染10分钟。
倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。
用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。
待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。

注意

选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂。
加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。

方法2

取二支洁净的小试管，分别加入0.2ml无菌水，再往一管中加入1—2接种环的蜡状芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入1—2接种环的生孢梭菌的菌苔，两管各自充分混合成浓厚的菌悬液。
在菌悬液中分别加入0.2ml苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热3—5分钟。
用接种环分别取上述混合液2—3环于两片载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95%乙醇冲洗至无红色液流出。
再用自来水冲洗，滤纸吸干。
取1—2接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然干燥后，油镜观察，在淡紫灰色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。